Microscopia.
Autor: Carlos Sepúlveda Mancilla.
El estudio detallado de los
componentes de células y tejidos animales o vegetales, por el tamaño que
poseen, requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar muchas veces más
la imagen de las estructuras que los constituyen, el instrumento que fue
empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula y los tejidos, es el
microscopio. El nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas: mikrós,
que significa pequeño y skopéoo, que significa observar.
El
microscopio es el instrumento insigne en el estudio histológico y uno de los
principales objetivos de la Histología es permitirle al estudiante la
comprensión de la estructura microscópica de las células, tejidos y órganos, al
mismo tiempo que se relaciona la morfología con la función (Ross, 2005) .
El
microscopio simple o lupa es un instrumento de
amplificación de imágenes que consiste en la utilización de una o más lentes
convergentes en un solo sistema óptico. Dependiendo de la curvatura de la
superficie de la(s) lente(s) las lupas pueden ampliar las imágenes de los
objetos desde 5, 8,10, 12, 20 y hasta 50 veces.
Los
microscopios ópticos compuestos
que se emplean actualmente tienen sus antecesores en los instrumentos ópticos
desarrollados, en el periodo comprendido entre 1590 y 1610, por Hans (padre) y
Zacarías (hijo) Janssen; quienes mediante el tallado cuidadoso de lentes
biconvexas construyeron los primeros microscopios compuestos.
Existen distintos tipos de microscopios, pero los podemos clasificar dependiendo de la fuente de energía que utilizan para poder formar la imagen, algunos emplean la luz (fotón) o un haz de electrones como fuente de energía para formar imágenes aumentadas y detalladas de objetos que a simple vista no es posible observar.
Se denominan compuestos porque la imagen se forma mediante la utilización de tres sistemas de lentes, cada uno de ellos constituidos por lentes convergentes y divergentes.
Sistema de lentes
Existen distintos tipos de microscopios, pero los podemos clasificar dependiendo de la fuente de energía que utilizan para poder formar la imagen, algunos emplean la luz (fotón) o un haz de electrones como fuente de energía para formar imágenes aumentadas y detalladas de objetos que a simple vista no es posible observar.
Se denominan compuestos porque la imagen se forma mediante la utilización de tres sistemas de lentes, cada uno de ellos constituidos por lentes convergentes y divergentes.
Sistema de lentes
- Lentes condensadores
- lentes objetivos
- lentes oculares
Componentes de un Microscopio óptico compuesto.
1.- Componentes mecánicos.
- Base o pie: Es un soporte metálico, amplio y sólido en donde se apoyan y sostienen los otros componentes del microscopio.
- Brazo, estativo o columna: Permite la sujeción y traslado del microscopio. Soporta al tubo óptico, a la platina y el revolver
- Platina: Superficie plana de posición horizontal que posee una perforación circular central. En ella se apoya la preparación (lámina portaobjetos que contiene a la muestra que se va a examinar) que se sujeta a la platina mediante pinzas o con un carrito o charriot que, mediante mandos especiales facilitan el movimiento de la preparación de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás.
- Tubo óptico: Consiste en un cilindro metálico que suele medir 160mm o 170 mm de longitud (dependiendo del fabricante del microscopio) el cual en un extremo, está conectado al revolver o porta objetivos y en el otro se relaciona con el (los) ocular(es).
- Revolver o porta objetivos: Es un componente que gira alrededor de un eje con la finalidad que los objetivos que sostiene coincidan de manera perpendicular con la perforación central de la platina. En su superficie inferior posee varios agujeros donde se atornillan los objetivos.
- Tornillos macrometrico y micrométrico: Generalmente están situados en la parte inferior del brazo o columna. Ambos tornillos permiten el desplazamiento de la platina hacia arriba y hacia abajo con la finalidad de acercar o alejar la preparación hacia los objetivos y así conseguir un enfoque óptimo de la imagen. El macrométrico produce desplazamientos evidentes y rápidos de la platina, en cambio el tornillo micrométrico produce movimientos imperceptibles de la platina y sirve para efectuar el enfoque fino y definitivo de la imagen. En la actualidad los microscopios tienen incorporados a los mecanismos de desplazamiento de los tornillos macro y micrométricos, topes de seguridad que impiden que éstos continúen descendiendo indefinidamente y así se evita roturas y daños a la laminilla y a las lentes de los objetivos.
- Cabezal: Es un componente situado en relación con el tubo del microscopio que alberga principalmente prismas o espejos que sirven para acondicionar en él dos o más oculares, o sistemas mecánicos que soportan cámaras fotográficas, de vídeo o sistemas de proyección de la imagen.
2.- Componentes ópticos.
- Condensador: Es el componente óptico que tiene como función principal concentrar y regular los rayos luminosos que provienen de la fuente luminosa.
- Objetivos: Los objetivos están considerados los elementos más importantes en la formación de la imagen microscópica, ya que estos sistemas de lentes establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez y la capacidad que tiene para captar los detalles de la misma (poder de resolución). Están constituidos también por un juego de lentes, en este caso, convergente y divergente, para eliminar, en la medida de lo posible, una serie de aberraciones o errores que afectarían la calidad de las imágenes formadas. Las lentes se disponen dentro de un soporte de metal, en cuyo exterior están inscritas una serie de anotaciones numéricas que indican: el aumento propio del objetivo, la apertura numérica, el tipo de material con que están tallados las lentes o la calidad que tendrán las imágenes, al anularse en la construcción de los objetivos, algunas aberraciones de las lentes o si se debe usar alguna sustancia de inmersión. Los objetivos se fabrican para ampliar las imágenes de los objetos observados en diversos aumentos; así se tienen objetivos con aumentos propios de 4x, 10x, 40x, y 100x. Algunos objetivos tienen alrededor de ellos una línea coloreada que indica a simple vista el aumento propio. Los objetivos también se clasifican de acuerdo al medio que existe entre el objeto examinado y la lente frontal del objetivo. Pudiendo ser SECOS o de INMERSION. La complejidad en la construcción de los objetivos y el número de lentes que se utilizan aumenta conforme se van corrigiendo más aberraciones. Por ejemplo un objetivo planapocromático suele incorporar en su construcción entre 10 a 12 lentes. Esto, en consecuencia, encarece el costo de ellos. La imagen que forman los objetivos es aumentada de tamaño, invertida y real.
La
capacidad que tienen los objetivos de formar imágenes en donde se distingan más
detalles del objeto examinado depende de una serie de factores como los que se
mencionan a continuación:
- Oculares: Es otro componente óptico del microscopio, debe su nombre porque la imagen final se observa a través de él acercando el ojo a la lente “ocular” del componente. Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el objetivo. La imagen del ocular es de mayor tamaño, virtual y derecho. Esta imagen únicamente amplía un número determinado de veces (5x, 8x, 10x, 12x) a la imagen formada por el objetivo. No añade, por más aumentos propios que posea, ningún detalle a los generados por el objetivo. En la generalidad de los casos, los oculares están construidos por dos lentes convergentes (planos convexos). La primera lente se denomina “de campo o frontal”, está situada en la parte anterior del ocular y, es la encargada de recoger y ampliar la imagen generada por el sistema de lentes del objetivo. La lente posterior, en contacto estrecho con el ojo del observador, se denomina lente “ocular” y es la responsable de aumentar nuevamente la imagen y orientarla hacia el ojo del observador.
3.- Componentes lumínicos: Se consideran dentro de este grupo a los instrumentos que
proporcionan energía luminosa al microscopio. Las fuentes de energía luminosa
son de dos tipos natural y artificial. La
luz natural, emitida por el sol, se obtiene de manera indirecta mediante un
espejo que posee una superficie plana y otra cóncava. La luz artificial
se genera a través de una lámpara de bajo voltaje (generalmente de 6 voltios)
que, mediante un reostato regula la emisión y la intensidad de luz. Al igual
que el espejo, este sistema de iluminación se inserta en la base o pie del
microscopio.
- Filtros: En diversas partes del recorrido de haz luminoso, aunque en la mayoría de los casos se sitúan entre la fuente luminosa y el condensador. Tienen por finalidad modificar la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto a observar. Por ejemplo, cuando se utiliza Son estructuras transparentes (de vidrio, plástico o gelatina) coloreadas que se localizan luz artificial es necesario emplear filtros azules pues modifican el color ligeramente amarillento que poseen los rayos luminosos que emite las lámparas eléctricas, transformándolos en rayos de luz “blanca”. Este color de luz es más aceptada por la retina y en las preparaciones histológicas coloreadas mejora facilita la rendición de color de las estructuras celulares o tisulares examinadas.
Aumento total del
microscopio óptico compuesto.
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AT: aumento
objetivo X aumento ocular
Ej: AT= (4x) X
(10x)= 40 veces aumentado.
|
El aumento total de la imagen del microscopio compuesto se
obtiene multiplicando el aumento propio del objetivo por el aumento propio del
ocular:
Se denomina
aumento vacío de la imagen de un objeto, aquel que por más ampliación que se
haga de la imagen, utilizando oculares de mayores aumentos, se llega a un punto
en que ya no se logran distinguir más detalles.
Poder de penetración
o de profundidad de campo.
Se denomina así a la distancia
que existe entre la superficie de la laminilla cubreobjetos y la lente frontal
del objetivo. Esta distancia será mayor cuanto menor sea el aumento propio del
objetivo y viceversa.
Microscopio
electrónico
Como se mencionaba brevemente al
principio del presente documentos existen distintos tipos de microscopios,
durante el desarrollo de esta guía solo de describe el microscopio óptico
compuesto o fotónico compuesto, es decir que utiliza luz como fuente de energía
para transmitir las imágenes a diferencia del electrónico que utiliza un haz de
electrones como fuente de energía para la formación de imágenes.
El microscopio fotónico u óptico (común) tiene una capacidad máxima de mostrar
detalles de la imagen de un objeto (poder
de resolución), cuando entre ellos existe una distancia aproximada de 0.2 de micrómetro. Este tipo de
microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolución mayor porque existen
dos factores limitantes: la longitud de onda (l)
de la energía luminosa utilizada y la apertura numérica (A.N.) de la lente del
objetivo. La única manera de aumentar el poder de resolución de un microscopio
era encontrar energía radiante con longitudes de onda menores a las que posee
el espectro radiante visible.
De este tipo de microscopio de
desprenden dos subtipos:
- Ø Microscopio electrónico de transmisión
- Ø Microscopio electrónico de barrido
Microscopio electrónico de transmisión.
Fue diseñado y construido
basándose en los mismos principios de un microscopio optico; con la diferencia
que en vez de usar energía luminosa emplea haces
de electrones y reemplaza las lentes ópticas (de vidrio) por “lentes” construidas mediante campos
electromagnéticos.
Sistemas que conforman un M.E de
transmisión
1. Cátodo: constituido por un filamento de
alambre de tungsteno que se calienta e irradia un chorro de electrones cuya
velocidad y longitud de onda están relacionadas con el voltaje de la energía
eléctrica que se le aplica.
2. Ánodo: encargado de orientar los haces
de electrones, reagruparlos y acelerar su recorrido.
3. Lente condensadora: primer campo
electromagnético). Los haces de electrones provenientes del ánodo son
concentrados por este primer campo electromagnético y dirigidos hacia este.
4. Soporte de la muestra: en este lugar,
dependiendo de la densidad que posean los componentes del espécimen los haces
de electrones los atraviesan, son absorbidos, reflejados o son desviados en su
recorrido. Las muestras deben ser secciones sumamente delgadas para permitir el
paso de los electrones. Generalmente se utilizan secciones de tejidos del orden
de 20 a 100 nanómetros. El escaso
grosor del espécimen dificulta la formación de la imagen por lo que es
necesario “teñir” o contrastar las secciones con soluciones de sales de metales
pesados (plomo, uranio, plata o vanadio), los cuales tienen cierta afinidad por
determinados componentes celulares.
5. Lente objetivo: (segundo campo
electromagnético). Los electrones que atraviesan la muestra o los desviados por
los componentes de la misma, llegan a esta zona donde son enfocados para formar
una imagen ampliada. Esta imagen es recogida por la Pantalla fluorescente o
placa fotográfica
6. Lente ocular o proyector: (tercer campo
electromagnético) que vuelve a enfocar la imagen y la proyecta, ampliada
también numerosas veces, hacia la pantalla fluorescente. Ésta es una superficie
plana constituida por un soporte de colodión donde se distribuyen partículas
muy finas de sales de zinc o de fósforo verde, las cuales emiten energía
luminosa (ondas de mayor longitud, visibles al ojo humano) cuando son
estimuladas por el choque de los electrones. Para obtener un registro
permanente de la imagen observada se reemplaza la pantalla fluorescente con una
placa fotográfica, cuyos componentes son estimulados por los electrones de la
misma manera que actúan los fotones.
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Microscopio electrónico de barrido (scanning).
Debes saber que…
El M.E de barrido, ofrece
imágenes con una resolución que alcanzan de 10 a 20 nm. Otra ventaja de
este microscopio es que forma imágenes con una gran profundidad de foco; de
aproximadamente 500 veces que la del microscopio fotónico. Esta propiedad
le confiere a la imagen su aspecto tridimensional
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USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO
A continuación se describen de
forma consecutiva los pasos que se deben seguir para enfocar una muestra en el
microscopio
- El banco y la mesa deberán encontrarse a una altura que le permita al observador el uso del microscopio en posición vertical y de manera confortable
- Encienda la fuente de iluminación
- Monte la preparación que se desea observar.
- Separe los binoculares ajustándolos a su propia distancia interpupilar.
- Asegúrese que cuando comience a trabajar debe encontrarse el lente objetivo de menor aumento (4X) en el eje óptico; es decir usted siempre debe comenzar a enfocar con este lente
- Comience a subir lentamente la platina con el tornillo macrométrico mientras observa por los lentes oculares hasta encontrar la distancia de foco (hasta que usted puede visualizar la muestra de forma nítida). Busque el enfoque fino con el lente micrométrico
- Luego gire el revólver hasta desplazar el lente de 10X al eje óptico, realice los ajustes necesarios con los tornillos de enfoque para lograr nitidez de la imagen
- Gire ahora hasta que el objetivo de 40X se encuentre en el eje óptico, se dará cuenta que la distancia de trabajo disminuye bastante. No baje la platina para pasar al lente siguiente, tenga en cuenta que el microscopio se encuentra calibrado de manera que cuando usted enfoca con un objetivo de bajo aumento y gira a uno de mayor aumento la muestra seguirá estando enfocada
- Sólo cuando se lo indique el docente puede enfocar con 100X, este lente requiere de aceite de inmersión para su uso. NO LO UTILICE EN SECO.
- Cuando termine de trabajar primero baje gradualmente los aumentos. Cuando haya llagado al objetivo de 4X, baje la platina. Baje la potencia de la luz y apague la ampolleta.
RECUERDA:
*El cambio de objetivo se hace siempre
moviendo los objetivos desde el menor aumento hasta el de mayor aumento, no
baje la platina al cambiar de objetivo
